FRAP关键技术简介
                        张志毅 周涛 巩伟丽 张德添
              （国家生物医学分析中心，北京太平路27号，100850）
    当前生命科学研究已进入分子水平，应用多种手段已获得大量关于细胞内分子的定性知识，基本了解了各细胞器的分子组成，找到许多在细胞生命周期中发挥重要作用的蛋白质，确认了许多重要蛋白质之间相互作用的存在并初步描绘出一些信号通路。但细胞的各种生物学功能和现象都是借助相关分子实现的，当前的研究重点和难点就集中于解答分子实现各种功能的机制。这就需要掌握活细胞生理状态下分子运动的各种信息，近年来发展的一些技术手段为获得有关重要信息提供了有力的工具，FRAP技术就是其中一种重要方法。
1、原理：
    荧光漂白后恢复（fluorescence recovery after photobleaching，FRAP）技术是上世纪70年代开创的利用荧光标记法研究活体细胞中各类分子迁移特性的技术。FRAP方法分为三个阶段――漂白前、漂白和漂白后恢复。漂白前和漂白后恢复都用尽可能弱的激光扫描全细胞，目的是得到扫描图像而不引起荧光淬灭，漂白阶段则使用强激光在短时间内扫描漂白区域，目的是使区域内的荧光全部淬灭。在整个过程中，监测漂白区域在各时间段的荧光强度变化并绘制曲线，从恢复曲线及其数据就可以得到关于分子迁移速率、动态分子比例等信息。
2、FRAP方法的基本要求：
    2.1选择合适的荧光探针。荧光染料是观察各种离子和其它非蛋白分子的首选荧光标签。绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）以及其后的一系列荧光蛋白的相继发现为FRAP技术应用于各种蛋白质开辟了新的广阔天地。应用FRAP技术的荧光探针应满足以下要求：
    ①其荧光的淬灭不具有自发可逆性；（有些荧光物的荧光被激发淬灭后还会自发地部分恢复）
    ②荧光具有一定稳定性，即在低强度照射时不会很容易淬灭。
    2.2具备精确可控的激光激发和荧光检测设备。激光扫描共聚焦显微镜的诞生，完全满足了这一要求，因而使FRAP技术迅速普及，今天已成为研究活细胞内各类分子迁移规律最重要的技术方法之一。
3、FRAP实验注意事项
    做FRAP实验还应当注意以下几点，否则就易得到错误结果。
    （1）注意实验温度的控制。实验和理论都表明温度对活细胞内分子的流动性有很大的影响，实验时温度要保持一致，最好能保持在生理温度下，才能最真实地反映自然状态。
    （2）漂白区域大小的选择和荧光恢复检测时间的长短要根据具体情况而定。漂白区越大，恢复越慢，因此流动快的分子漂白区域可以大一些，这样才能够清楚的观测到恢复过程。在多次重复FRAP实验时，漂白区的形状尽量简单，大小保持一致，将为以后的计算提供很大便利。
    （3）激发光的波长和强度应不会使细胞严重损伤；尽量减少漂白前和漂白后的荧光淬灭；
4、FLIP实验
    荧光漂白损失（Fluorescence Loss In Photobleaching，FLIP）是FRAP实验的延伸。多次重复FRAP实验，细胞内流动的荧光分子不断补充到漂白区被淬灭，最后流动荧光分子全部被漂白后，非流动的荧光分子的分布就显现出来，由此可以获悉被标记分子在漂白区与其它区域的之间的连续性信息，实际上可以反映出细胞内区室的划分。FLIP实验已广泛用于蛋白质在各细胞器的定位研究。
5、FRAP主要参数
    FRAP实验结果中反映分子迁移特性最重要的两个参数是：动态比M（mobile fraction）和扩散系数D（diffusion coefficient），此外还有半恢复期t1/2。
    动态比M反映了所选区域内标记荧光的分子中动态分子的比例，它可以反映该分子在区域的组成结构中的作用，为构建各细胞器的分子理论模型提供佐证。计算较简单和统一。
    扩散系数D是物理学参数，单位为μm2/s或cm2/s，它直接反映了分子扩散的定量特征，是定量构建分子机制模型的重要参数。它的计算比较复杂，基本依据是物理学中的扩散方程。但目前的计算模型难以统一且比较复杂。
    t1/2表示在荧光恢复到最后稳定值的1/2时的t值，它是荧光恢复速率快慢的一个简单直接的表征，在一些求D的公式中也要用到t1/2. 求t1/2可直接从曲线图或数值表中读出。