激光扫描共聚焦显微镜同步检测细胞的金颗粒和荧光信号
                  袁兰1，孙志伟,2 王宏芳,2 张秀芝,2 陈月月,2 李娟*2，
                       （1北京大学医学部，2吉林大学，*通讯作者）

前言 采用激光扫描共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscope，CLSM)检测荧光信号变化的方法（1,2），发现胶体金颗粒材料对细胞的生物结构和功能有影响（另文发表），但用CLSM还不能确认金颗粒是否真正会与细胞结合，其难点在于金颗粒本身无荧光，用CLSM检测荧光的通常方法难以采集到其信号。因此在该类研究中，亟需建立一种检测方法：既能够看到细胞上结合的金颗粒又同时观察到其引起的荧光信号的变化。就该问题本文进行了以下研究。

材料和方法
1 仪器及条件
    CLSM光谱扫描条件：激发光488，543，633nm，发射光谱400～700nm；扫描步距7 nm。 采集荧光图象条件：根据荧光探针选择相应的激发光和发射光波长，如果有光谱交叉，采用顺序扫描法采集相应的荧光图象。
2 胶体金颗粒的制备:采用柠檬酸三钠还原法制备金溶胶[3] 。
3 细胞与胶体金颗粒的作用:用金胶体颗粒与活7702细胞作用2小时，将细胞洗涤两次后用4%甲醛固定,再用FITC、phalloidin-TRITC和Hochest33258 标记细胞（1）
实验结果
1 金颗粒的检测光光谱及成像：
    用488nm激光照射与胶体金颗粒的作用细胞样品，并在400～700nm波段内对检测光进行光谱扫描，。发现其光谱上在480～495nm能够采集到其图像（见图1）,即存在峰值，并且在整个检测光光谱中只有这一个峰，其他波段无信号检出。而未加金颗粒材料的对照组在相同条件下则无该光谱峰存在。

    进一步改用其他波长的激光照射样品并进行相同的检测光光谱扫描，发现其相应光谱上也存在峰值。图2展示了488、543和633nm激光照射下细胞金颗粒的检测光扫描光谱,表1 中则列出了金颗粒上述光谱的基本参数。

    图2和表1结果说明（1） 488、543和633nm各激光照射金颗粒样品后所得到的检测光光谱都有一个特征峰，该峰是以相应激发光波长为中心、峰宽度均为15 nm的锐峰。根据上述光谱和金颗粒的表面性质可知，上述峰信号是金颗粒的反射光信号，这表明用CLSM能够采集到金颗粒的反射光图像。（2）488、543和633nm激发光都可以用于采集反射光，而且在400～700nm范围内反射光只在激发波长处占用了15nm宽的波段，其余的波段均无信号检出。
    图3（a）展示了细胞结合的金颗粒的反射光图像。而对照组（未加胶体金颗粒的细胞）在相同的条件下则没有检出反射光信号（见图1）。照射样品的激光越强，则金颗粒的图像越亮。经confocal测定，金颗粒的最小径为400nm。

2 多通道同时采集反射光图象和荧光图象
    上述金颗粒光谱显示，金颗粒反射光峰只占用以激光波长为中心的小于15nm波段。表2是对金颗粒反射光与荧光信号的比较。由于荧光的波长比激发光波长长，可以推测反射光未占用的其他波段可以同时用于检测样品的荧光，因此反射光与荧光同步成象是可能的。我们利用CLSM也确实能够同步采集到细胞结合的金颗粒与细胞的其他三种荧光信号的图像（图4）。

    实验还发现上述四通道还能够同时沿着z轴方向以“CT”的方式采集多层面反射光和荧光图像。

讨论 现代激光扫描共聚焦显微镜的特点之一是激光强度、检测孔光栏（pinhole）、PMT灵敏度、激发波长和检测波长均可调节和选择，这些特点在荧光成像和反射光成像中发挥了优势。从原理上讲，荧光信号和金颗粒反射光信号成像所经过的路径相似，两种信号都需要激光作光源，都是从样品发出，经过pinhole后到达检测器。这些可以解释为什么金颗粒反射光能够象荧光一样成像、进行光学切片，光谱扫描等。 同时CLSM检测的是金颗粒对激发波长的反射光，该波长不会干扰荧光成像。
结语 本文用激光扫描共聚焦显微镜通过光谱扫描的方法得到了400～700nm波段内反射光的光谱，从而找到了采集细胞金颗粒反射光图像的方法，并进一步确立了多通道同时检测反射光和荧光的方法。研究表明，利用反射光图象可以采集到的金颗粒的最小粒径是400uM。金颗粒反射光与荧光可以同步进行图象的采集、光学切片、荧光定量和光谱扫描。这些成像方法的建立为研究金颗粒在细胞上的结合及其对生物学功能的影响打下了基础。

参考文献
[1]袁兰主编《激光扫描共聚焦显微镜技术教程》,北京大学出版社,2004.
[2] Lijuan Zhang, Xiaoqun Mu, Juanling Fu, Zongcan Zhou , In vitro cytotoxicity assay with selected chemicals using human cells to predict target-organ toxicity of liver and kidney.Toxicology in Vitro 21 (2007) 734–740
[3]Frens,G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions[J]. Nature Physical Science, 1973,241(1): 20-22