应用GC-MS检测确证尿样中4种β2－兴奋剂残留技术研究

凌建刚1,2 ，赵健2 ，陈国2 ，朱勇2，吴平谷3

（浙江大学环境工程系1，杭州310029；农业部农产品质量安全监督检验测试中心（宁波）2，宁波315040；浙江省疾病预防控制中心3，杭州 310009）

摘要：气相色谱－质谱仪即GC-MS技术是当前确证盐酸克仑特罗、莱克多巴胺等多种β2－兴奋剂的理想手段。本文借助GC-MS 的全扫描（scan）和选择离子碎片监测（sim）技术相结合，采用简化的前处理方法，通过标准添加和对酶联法阳性样品再确证，对生猪尿样中多种兴奋剂残留进行确证研究，具有准确率高、速度快、成本低。该方法最小检出限为0.5 ug/kg。

关键词：气相色谱 质谱激素 确证检测

A Multiresidue Method for the Determination and Definite evidence of 4 β2-Hormones Residues in Urine kind by GC-MS

LING Jian-Gang1，2,ZHAO Jian2，CHEN Guo2，ZHU Yong2，WU Ping－Gu3

（Environment Engineering Department of Zhejiang University, Hangzhou, 310029;The Supervision, Inspection & Testing Center (Ningbo) Of Agricultural Products Quality ＆ Security，Ministry Of Agriculture ，Ningbo, 315040; The Center of Prevention and Control of Disease of Zhejiang3,Hangzhou,310009）

1、           前言

近年来，“瘦肉精”受到严查，一些不法商贩就想方设法使用替代品。目前，市场上已先后出现两种“瘦肉精”的替代品－莱克多巴胺、沙丁胺醇。作为盐酸克仑特罗（瘦肉精）的替代品，莱克多巴胺、沙丁胺醇等新一代β2-兴奋剂已对我国畜产品和饲料安全构成新的威胁。盐酸克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等均属兴奋剂类药物，人体的累计摄入量超过一定值或食用了高残留的内脏组织，易出现毒副作用，因此包括我国在内的许多国家都将其列为违禁药物。鉴于国家和行业检测标准的相对滞后，上海、浙江等地先行制订了饲料、尿样等基质中盐酸克仑特罗和沙丁胺醇两个激素的单项检测方法，目前国内尚无上述激素多残留检测方法。克仑特罗、莱克多巴胺特异性酶联免疫试剂盒初筛阳性者必须由GC-MS确证，并进一步查沙丁醇胺和特布它林残留。

2、            实验部分

2.1 主要仪器、材料和试剂

仪器：美国安捷仑Agilent 6890N-5973MSD气相色谱－质谱联用仪（四极杆，EI离子源， MSD chem. NT4.0英文工作站，HP-5MS弹性石英毛细管柱，柱长30 m、内径0.25 mm、膜厚0.25 mm）；高速离心机，涡流混合器（或超声波混合器），固相萃取（SPE）装置；旋转蒸发仪，氮吹仪，烘箱。

材料：生猪尿样、SLS净化柱（500mg/5mL）、SLH净化柱（500mg/5mL）。

试剂：正己烷，甲醇，甲苯，蒸馏水，氨化甲醇（2％，5％），无水硫酸钠，盐酸（1：1，30mmol/L），衍生试剂：99%BSTFA（双三甲基硅基三氟乙酰胺）+1%TMCS（三甲基氯硅烷）。

标准溶液：克仑特罗、莱克多巴胺、特布它林、沙丁胺醇标准甲醇储备液100ug/mL，用甲醇（色谱纯）稀释至1ug/mL标准工作液。

2.2 仪器工作条件

2.2.1 气相色谱条件

载气为99.999％高纯氦气，柱前压80Kpa，柱流速1.0 ml/min；不分流进样方式； 进样口温度：230 ℃；传输线温度：250 ℃；进样量2mL；升温程序：初始温度120 ℃，保持3 min，以10 ℃/min速率升温至280 ℃，保持7 min；

2.2.2 质谱条件

EI离子源，电子能量70 eV，温度230 ℃；检测器电压为1.42 kV；全扫描（Scan）质量范围：50-500 amu；选择离子扫描（SIM）特布它林（86，356）、克仑特罗（86、262、243）、沙丁醇胺（86、369、440）、莱克多巴胺（250、267、502）组成离子组；质谱仪经全氟三丁胺（PFTBA）自动调谐，灵敏度和分辨率达到最佳匹配；溶解延迟6min。

2.3 分析步骤

2.3.1 样品提取

方法一：取尿样10mL于25mL离心管，用1mol/L NaOH调pH10，加1g NaCL,振摇溶解，加10mL叔丁基甲醚，涡旋1min，中速振荡10min，5000rpm离心5min, 上清液经无水硫酸钠过滤，收集于50mL旋转蒸发瓶；另取10mL叔丁基甲醚重复提取一次。用2mL甲醚淋洗无水硫酸钠，合并滤液，旋转蒸干，用2mL乙酸乙酯溶解，待过SLS柱。

方法二：取尿样5mL（批量检验时每10份加1ug/mL 混标工作液200ul作加标回收控制）,用1:1HCL调pH2,离心，待过SLH柱。

2.3.2 样品净化

方法一：SLS柱活化（依次用5mL甲醇，5mL水，5mL 3mmol/l HCL），上样，然后用5ml水，5ml甲醇淋洗，最后用10％氨化乙酸乙酯洗脱，收集于10ml试管，加入无水硫酸钠，涡旋，离心，取5ml清液，吹干，加2.5ml乙酸乙酯，2.5ml乙醚，超声10min，离心5min，氮气吹干，待衍生。

方法二： SLH柱活化（依次用5ml甲醇，5ml乙酸乙酯），上样，用5mL50％甲醇/乙酸乙酯洗脱，另取3ml3％甲醇/乙酸乙酯洗涤旋转瓶，过柱，收集洗脱液，氮气吹干，待衍生。

2.3.3 衍生

加100ul衍生试剂，混匀密封后置80℃烘箱衍生30min，氮气吹干，加200ul甲苯溶解， 2uL GC－MS手动进样或用带衬管的进样瓶自动进样。

3、结果与讨论

3.1 提取方法的选择

方法一是DB33/T536-2004 第三法GC-MS法采用的方法，步骤较繁琐；比较而言，方法二具有快速、简便等优点，更适用于批量样品的提取。提取的回收率可达到86.8%，与方法一接近。

3.2 净化方法的选择

常用的净化方法有液-液分配法、SPE法等。液-液分配法简单，但净化效果较差；SPE净化法操作过程较繁琐，但净化效果较理想。因尿样提取液成分较复杂，会干扰检测，故选用SPE净化法。但不同组分的SPE柱其过柱程序不同，采用SLH柱程序较简便。

3.3 色谱条件的优化

尿样经过净化处理，但部分杂质依然存在，为达到分离完全，避免杂质干扰测定，本文选择程序升温，并采用低流失毛细管MS专用柱。为了对组分进行准确的定量分析，本文选择不分流进样方式，避免分流进样时分流比的轻微改变对定量结果重现性的影响。

3.4 质谱条件的优化

采用自动调谐，以提高灵敏度。为了确证组分，先采用SCAN全扫描对衍生后的标样进行定性分析，获得目标组分的全质谱图及其保留时间等信息，见图1、图2。由于NIST98库中只有盐酸克仑特罗标准质谱图，莱克多巴胺、特布它林、沙丁胺醇三个组分，本文通过较高浓度标样SCAN方式建立保留时间和典型质谱图，见图3、图4；再采取选择离子扫描（SIM）对该样品进行定量分析。

3.5 方法的回收率和检出限

向5mL 尿样中加入1.0 mg/L 4种混标溶液20OuL，按照上述方法进行回收试验，方法一回收率为89.2 %，方法二回收率为86.8％。本方法最小检出限为0.5 ug/kg。

4、         结论

本研究建立了应用GC-MS一次性检测确证尿样中克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布它林等4种β2－兴奋剂的技术。对4种兴奋剂应用同一提取、净化（方法二）及GC-MS测定程序，提高了检测效率。该方法具有快捷的前处理和准确确证能力。气相色谱－质谱联用技术在激素、抗生素、农残等的定性定量分析方面具有较强的优越性，尤其是在样品中干扰杂质较多的情况下，通过质谱快速准确的定性检测具有十分重要的意义。