气相色谱法检测卷烟烟气中芳香胺类物质的试样前处理
毛友安*    刘巍   钟科军    梁进平
（常德卷烟厂技术中心，湖南常德  415000）

   摘  要：综述了气相色谱法检测卷烟烟气中芳香胺类物质的试样前处理方法，讨论了溶剂萃取法、固相萃取法和同时蒸馏萃取法优缺点。认为虽然某些前处理方法能得到比较满意的结果，但由于卷烟烟气基体背景十分复杂，研究建立新的操作简便、快速、回收率高、重现性好、成本低的试样前处理方法仍然十分必要。
   关键词：卷烟烟气；芳香胺；试样前处理

SAMPLE PRETREATMENT FOR DETECTION OF AROMATIC AMINES IN CIGARETTE SMOKE BY GAS CHROMATOGRAPHY

MAO You-an, LIU Wei, ZHONG Ke-jun, and LIANG Jin-ping
(Changde Cigarette Factory, Changde 415000, Hunan)

Abstract: Methods of sample pretreatment for the determination of aromatic amines in cigarette smoke by gas chromatography (GC) were reviewed. The advantages and disadvantages of liquid-liquid extraction, solid phase extraction, and simultaneous distillation and extraction were discussed. It was believed that although the acceptable results might be obtained by some of these methods, it was still necessary to develop a new sample pretreatment method, which should be simple and fast, and have high recovery and reproducibility and low cost, for determining aromatic amines in cigarette smoke with GC because of the very complicated matrix background in the smoke.
      Keywords: cigarette smoke; aromatic amines; sample pretreatment

1. 引言 

   早在20世纪60年代，就有烟草工作者研究了烟草中的芳香胺类物质 [1,2]。烟草中的芳香胺大多数是与苯胺相关的化合物，包括那些在苯环上取代的和在N原子上取代的化合物。取代基一般为烷基、甲氧基和苯基。到目前为止，已发现的存在于烟叶或烟气中的芳香胺类物质总共有50余种，其中大部分只在烟气中存在。烟叶中芳香胺可能来自于烟叶中蛋白质和或氨基酸通过酶或微生物的去羧降解反应（如苯基丙氨酸或酪氨酸）。在烟气中，芳香胺部分可能是烟支燃烧时烟叶中芳香胺直接进入烟气，另一部分是吸烟时烟叶成分热裂解产生的，如烟碱、蛋白质和氨基酸的热解产物（如萘胺的形成）。
   烟气中一些芳香胺是致突变物和致癌物，能与蛋白质或DNA形成加合物。1997年国际癌症研究机构关于卷烟主流烟气中致癌物质的研究表明，4-氨基联苯、2-萘胺是人体致癌物， 其中2-萘胺被认为是一种膀胱致癌物[3,4]，1-萘胺、3-氨基联苯是致突变物。酪胺（由酪氨酸去羧基得来）是一种具有血管活性的胺类，在对哺乳动物静脉注射酪胺时，能明显提高血压。另一方面，N-取代的芳香胺可能是N-亚硝胺的前体物，而N－亚硝胺也具有致癌活性[3]。因此，烟草和烟气中痕量芳香胺类物质的测定对于吸烟与健康的研究与评价具有十分重要的意义。
   芳香胺作为环境污染物存在于许多环境介质中，如空气、水和土壤。因此，其检测方法研究一直受到重视，已提出的方法有毛细管电泳、高效液相色谱、气相色谱或气相色谱/质谱联用等。然而，对于烟草体系而言，由于基体成分非常复杂，毛细管电泳与紫外检测结合的方法灵敏度低，干扰较为严重。高效液相色谱法和紫外或荧光检测结合的方法则操作繁琐，耗时长，色谱分析时存在比较大的干扰[5]。而气相色谱与质谱、电子捕获或氮磷检测器等结合的方法则具有较高的特异性和灵敏度，在烟草体系中采用的较多。烟叶中芳香胺含量和种类都比较少，且由于与人体直接关系不大，其有关检测方法研究的文献较少，国外烟草工作者在早期曾经讨论过[6]。卷烟烟气中芳香胺类物质的检测研究开始于20世纪60年代，如Pailar等人从1966年到1967年的研究工作[2]、Hoffmann及其小组在20世纪60年代晚期到70年代的研究工作[7,8]。此后，人们对卷烟烟气中芳香胺类物质的检测方法开展了许多研究[9-11]。
    气相色谱技术用作卷烟烟气中芳香胺的检测技术已经比较成熟，采用的分离柱由早期的硅酸镁填充柱逐步发展为毛细管柱。最早由Hoffmann使用气相色谱－电子捕获检测器法（GC/ECD）检测烟气中芳香胺含量[7]，检测下限为1ng/l。2004年Mola 等[12]用GC/ECD检测了烟气中属于Hoffmann有害物质名单中的4种芳香胺。1996年Kijima等[13]用气相色谱－火焰光度检测器法（GC/FPD）定量检测了烟气中芳香胺的N－二甲基硫磷衍生物，其色谱峰稳定且单一对称，检测限可达到30pg。气相色谱－质谱法（GC/MS）是目前常用的方法[10,11]，质谱法检测定量准确，重现性好，但限制之一是必须能得到每种待测物组分的标准物。在气相色谱法检测卷烟烟气中芳香胺类物质时，由于烟气试样背景十分复杂，样品前处理是必不可少的环节，它将影响分析方法的可靠性、准确性以及分析通量。本文拟简要综述卷烟烟气中芳香胺类物质的气相色谱检测中试样前处理方法的研究进展。

2. 气相色谱法检测卷烟烟气中芳香胺的一般步骤 

    由于芳香胺类物质在卷烟烟气中的含量很低，只有微克级或更少，而且烟气中化学成分十分复杂，目前已知的烟气化学成分达3870多种。因而，在卷烟烟气基体背景下，存在许多干扰物质，很难和芳香胺分离。因此在进行气相色谱检测前，必须对试样进行分离纯化。卷烟烟气中芳香胺的分析过程一般可分为四个步骤：① 从卷烟烟气及其冷凝物中提取芳香胺类物质；②含芳香胺的提取物的分离纯化过程；③ 芳香胺的衍生化过程；④ 气相色谱法检测。
为了收集卷烟烟气气相和粒相物中的芳香胺，一般采用自动吸烟机抽吸卷烟，使吸取的烟气通过剑桥滤片和装有收集液的吸收瓶。收集液一般为酸性溶液，通常为磷酸与甲醇 [14]的混合液(1:1)，或含有0.8mol/L抗坏血酸的5%盐酸溶液[13]，或7% 盐酸 /甲醇（1:1）溶液[7,15]。文献[16,17]则采用直接将烟气通过剑桥滤片，然后将剑桥滤片浸入酸性溶液（5%HCl）的方法进行收集。
为了避免在试样前处理过程中损失烟气中的芳香胺，文献[14]采用了截获反应物方法(intercept-reactant method)，效果明显。在进行定量分析时，一般在酸性收集液中加入内标物。

3.气相色谱法试样前处理方法的研究

    在气相色谱法检测卷烟烟气中芳香胺类物质中，试样的前处理方法主要有：一次或多次液-液萃取法、固相萃取方法、同时蒸馏萃取法等，然后将芳香胺类分子中的氨基衍生化。

    1.溶剂萃取法

    溶剂萃取法在试样前处理过程中是一个必不可少的步骤。在烟气芳香胺类物质的萃取中采用的萃取剂通常为有机溶剂，如乙醚、正己烷，苯等，萃取剂的选择主要与待分析的芳香胺成分有关。1969年，Hoffmann等[7]采用溶剂萃取的纯化方法结合气相色谱/电子捕获检测器，首次定量测定了烟气中ng级的1－萘胺和2－萘胺，标样回收率在60－75%之间。该法在得到烟气中芳香胺的收集溶液后，用乙醚作为萃取剂反复萃取了7次。溶剂萃取过程中有的芳香胺可能会被氧化，因此文献[13]加入抗坏血酸作为抗氧化剂 。
溶剂萃取法仪器设备简单，实验成本低，但实验操作繁琐费时，而且回收率比较低，对于改善检测下限不利，对环境污染也比较大。因此，目前已较少单独使用溶剂萃取法，而是与固相萃取法、同时蒸馏法等新型纯化方法结合使用。

   2.固相萃取法

    固相萃取技术（SPE）是利用吸附剂或离子交换树脂将液体样品中的目标化合物截留，与样品的基质和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱，达到分离或者富集目标化合物的目的。固相萃取实际上采用的是液相色谱的分离原理，分离模式主要包括反相和正相。固相萃取所用的吸附剂与液相色谱常用的固定相相同，只是在填料的形状和粒径上有所区别。一般来讲，固相萃取填料的粒径分布较液相色谱柱中的要宽，而且固相萃取小柱是一次性消耗品。固相萃取技术作为一种高效的样品制备技术，近年来得到越来越广泛的重视和应用。
   1995年，Grimmer等[14]将一种离子交换剂（Bakerbond aromatic sulfonic acid）置于玻璃小柱的两个特氟伦滤片之间，构成简易固相萃取系统（使用前用1mol/L磷酸活化）。该法用苯两次萃取混合卷烟烟气中芳香胺收集液，浓缩加入甲醇后通过上述柱子，然后用苯洗脱，得到的苯洗提液蒸馏浓缩、衍生化后作气相色谱检测。测得混合型卷烟烟气中含有13种芳香胺，回收率为59%-102%。2003年，Smith等[17]对上述方法做了进一步改进，提出通过两步不同保留机理的固相萃取技术净化试样。第一步采用阳离子交换法，即用5%HCl溶液萃取混合液后，使芳香胺带上正电荷，然后通过设计有苯磺酸基团的MCX剑桥滤片，再用NH4OH洗提，这一步可以去掉许多中性和极性化合物。第二步为疏水保留，将芳香胺混合液通过Waters Oasis HLB柱子，然后用甲醇与水混合液作洗提液，同时研究了不同比例的甲醇与水混合液对洗提的影响。表明甲醇：水（30：70，V/V）能得到较好的结果，如果增加甲醇的比例会得到更加干净的洗提液，但是会损失更多极性较大的芳香胺。该方法较前面的方法灵敏度高，稳定，易操作。检测限范围由0.02ng/cig联甲苯胺到1.41ng/cig苯胺，回收率在79－109%之间。
    固相萃取法作为一种非常有用的分离富集方法，与溶剂萃取方法相比在分析卷烟烟气中芳香胺类物质时具有能大大减少溶剂消耗和废物产生、能提供多种分离模式选择、回收率高、简单易行、重现性好、易于实现自动化等优势。但是也有一定局限性，如受现有萃取小柱极性的限制，只能检测到一些芳香胺类物质中极性相近的组分，对极性相差较大的芳香胺类物质，其检测结果不能令人满意。
3.3同时蒸馏萃取法
    同时蒸馏萃取技术(SDE)是使用同时萃取装置，使水相与有机相在同时蒸馏萃取装置中充分混合，从而把与水共沸腾的待测物质萃取转移至有机相中。该技术运用于烟气中芳香胺的检测，集萃取、蒸馏于一身，步骤少、操作简单快速。2000年Forehand等[18]采用同时蒸馏萃取法，以CH2Cl2作为萃取溶剂，测定了1R4F卷烟粒相烟气中苯胺、1－萘胺、2－萘胺、3－氨基联苯、4－氨基联苯、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、2－乙基苯胺、2，5－二甲基苯胺、2，4－二甲基苯胺、3－乙基苯胺，4－乙基苯胺、对二氨基联苯、联甲苯胺等15种芳香胺物质，前处理简化为一步，得到的芳香胺含量的值与文献值相近，但加标回收率较差，重复性不好。Smith等[17]重复了文献[18]的工作，并与SPE法作了对比，发现两个方法得到的结果相差比较大，各测定成分互有高低，其中对二氨基联苯、联甲苯胺相差很大，这可能与它们较差的相对标准偏差值有关，而且SDE相对SPE有部分芳香胺物质未能检测出。
    目前用于卷烟烟气中芳香胺气相色谱分析的上述三种预处理方法各有利弊，其中溶剂萃取法由于其操作繁琐，对环境污染较大，已较少单独采用。同时蒸馏萃取法虽然操作简便，设备简单，污染较少，但是分析时间较长，且存在对部分芳香胺萃取不完全或萃取不出的现象，对分析造成一定困难，这些问题需要进一步研究。固相萃取法用于芳香胺的检测的预处理优势比较明显，标样回收率高，重复性好，精度较高，但过程复杂冗长。因此，如何设计出新型专用固相萃取柱，简化其分离纯化步骤，提高分析效率，需要进一步开展研究。
3.4 衍生化方法
    用色谱检测芳香胺化合物前，需将芳香胺化合物酰化，以保护氨基。芳香胺的衍生化方法根据所要检测的芳香胺的不同而略有不同，高挥发性的芳香胺在气相色谱分析前常用三氟乙酸酐，或类似的酰化试剂衍生化。Kijima等[13]用含16%二甲基氯硫代磷酸盐的乙氰溶液作酰化剂，加到未完全分离的烟气吸收液中直接酰化，加热至60oC，静置30min，再用正己烷萃取。然后用GC/MS检测，试样中加入的标准芳香胺回收率能达到90-108%。Smith和Forehand[17,18]等采用七氟丁酸酐（HFBA）作酰化剂在80 oC反应30min，试样中芳香胺的回收率为79-109%。Grimmer 和Stabbert 等[14,19]采用五氟丙酸-咪唑作酰化剂，50 oC沙浴，反应15min，试样中芳香胺的回收率为86-95%。

4.结束语

    用于气相色谱检测卷烟烟气中芳香胺类物质的试样预处理方法由早期的溶剂萃取法，逐步发展为同时蒸馏萃取法、固相萃取法等。同时随着气相色谱仪器的不断改进，大大改善了分析检测下限，在烟气中发现了许多以前没有发现的芳香胺类化合物。然而现有的某些试样预处理方法虽然能给出可接受的结果，但是往往不是操作繁琐、费时长，就是重复性差，回收率也需要提高。另一方面，烟气化学成分复杂，许多烟气成分（尤其是芳香胺类物质）在预处理过程中可能继续被氧化或发生反应。因此，随着社会公众对吸烟与健康问题的日益关注，研究建立快速、准确测定卷烟烟气中芳香胺类物质的分析方法，尤其是发展基于气相色谱检测技术的新型试样前处理方法，仍然是一项较为迫切的研究任务，这方面还有很多工作要做。

参考文献（略）

联系人：毛友安
通信地址：415000 湖南省常德市洞庭大道199号
                    常德卷烟厂技术中心
联系电话：0736－7294553     (0)13808475057
传真号码：0736－7299381
E-mail: youanmao@126.com

* 通讯联系人，理学博士，研究员，主要从事烟草化学、分析化学研究。