动物源性食品中喹诺酮类药物残留分析进展
刘芃岩1 车宜平1 国占生2
(1河北大学化学与环境科学学院，河北 保定　071002；
2衡水学院应用化学系，衡水，053000)

摘要 本文对动物源性食品中喹诺酮类药物残留的分析方法进行了综述。从酸化或碱化溶剂提取、固相萃取（SPE）和液-液萃取（LLE）净化、高效液相色谱分离、检测四个步骤分别进行了评述。
关键词 动物源性食品 喹诺酮 残留分析 评述
Abstract This review describes the main methods of residues analysis of quinolones in the food from animals. These methods include extraction using acic or bacic solvents, purification with solid-phase extraction and liquid-liquid extraction, separation by high-performance liquid chromatograhy and determination.
Keywords Animal products; Quinolones; Residue analysis; Review

前言
    喹诺酮类（QNS）药物广泛的应用于治疗人和动物的感染性疾病，主要的作用机理是抑制DNA拓扑酶Ⅱ。此类药物抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透力强，而且价格低廉，因此已成为兽医临诊和水产养殖中最重要的抗感染药物之一。
喹诺酮类药物都含有吡酮酸，1962年出现的萘啶酸和后来的奥啉酸、吡咯酸被称为第一代喹诺酮类，70年代开发的吡哌酸、氟喹酸被称为第二代喹诺酮类，80年代以来出现的第三代喹诺酮类，因有氟原子而被称为氟喹诺酮类（FQS）。在水溶液中，3位上的́羧基使分子显酸性，而7位哌嗪基上的氨基团又使其显碱性，因此，常以阳离子、两性离子和阴离子三种形式存在，酸解离常数(pKa1)≈6，碱解离常数(pKa2)≈9，等电点(pKI)≈7。常用于兽药的喹诺酮类的分子结构如图1。
 

图1 常用兽药喹诺酮类分子结构

    由于喹诺酮类药物广泛用于可食性动物，其残留可导致人体内病原体的耐药性，所以欧盟（EU）和FAO/WHO 食品添加剂联合专家委员会 (JECFA)早就规定了几种喹诺酮的最大残留量[1]。最大残留量的规定为提高检测能力和发展新的检测方法提供了参考。现在食品中残留的喹诺酮的检测研究中，多残留检测已成为重点。比如：鸡肉中的CIP、DAN、ENR、SAR、DIF、OXO、FLU等QNs的测定[2,3]、Schneider等[4] 对鸡蛋中的8种QNs的检测，Marazuela等[5]对牛奶中的CIP、ENR、MAR、DAN、SAR的测定、以及Johnson和施兵等对水产食品中QNs的测定[6, 7]等等，都分别对不同食品中的多种QNs药物进行了分析，多种药物同时分析可提高工作效率，降低成本，节约试剂，减轻环境污染。
    本文对喹诺酮类药物残留的分析方法进行了综述，为建立动物源性食品安全检测体系提供参考，以便提高监督检验水平，减少因出口食品被扣、退货等造成的贸易损失。

1提取
    喹诺酮类在多数溶剂中溶解性差，在pH≤4或≥9时，易溶于含水相溶液（质子化或酸解离），pH为6－8时，水溶性最差。因此，绝大多数样品使用酸化或碱化溶剂作为提取溶剂，如：乙睛－偏磷酸溶液，甲醇－磷酸溶液，丙酮－乙酸溶液，丙酮－氢氧化钠溶液等。
由于动物性食品中常含有大量的蛋白质和脂肪，因此，在提取样品时应考虑到同时除蛋白、脱脂，一般提取时用甲醇、乙腈、二氯甲烷、三氯乙酸作溶剂除蛋白，提取液用正己烷萃取脱脂。Marazuela等[5]在提取牛奶中的CIP、ENR、MAR、DAN、SAR时，用乙腈提取，分别用三氯醋酸和超滤的方法除蛋白，通过两种方法的比较，发现用三氯乙酸沉淀的有明显高的回收率（72～90%），而用膜超滤的方法回收率只能达到50%左右。分析原因，主要是由于TCA沉淀了牛奶中的蛋白，避免了与FQS的直接作用，或者是避免了FQS被滤膜的吸附。用磷酸或草酸与乙腈联合使用除蛋白同样有效 [8]。
    除用溶剂除蛋白和脂肪外，新的提取方法---超临界萃取（SFE）和双相渗透同样有效。如：Shen[9]等对口服了NOR和OFL的鸡的肌肉样品进行了超临界萃取，提取后的样品不再需要进一步的净化，优化了SFE的提取条件后，每一种喹诺酮都得到了足够高的回收率；比起溶剂提取，SFE更经济、环保、简单；Lolo等人[10]对鸡蛋中的ENR和CIP采用双相渗透作为新的提取方法，并对双相渗透条件：pH值、溶剂、温度、振摇速度和时间进行了优化，实验发现，pH为6时，回收率最高；而选用二氯甲烷、氯仿、叔丁基甲基醚等不同溶剂提取时发现二氯甲烷最好，用非极性溶剂提取，回收率非常低；最佳提取温度是60℃；提取时间从1h到5h，时间越长回收率越大，4.5h后回收率不再增加；振摇速度分别在100、150、200rpm时进行了测试，150rpm时得到最大回收率。

2净化
    由于检测的样品基质复杂，干扰成分多，所以在分离测定前需要净化。常采用的方法有固相萃取（SPE）和液－液萃取（LLE）。固相萃取常采用反相柱C18和C8柱。过柱之前，用水、酸溶液、乙腈－水或甲醇－水混合液或低浓度的有机溶剂的混合液进行活化。最常用的洗脱液是纯的甲醇和酸性或碱性的甲醇－水混合液（含有大于20%的甲醇）。
在SPE净化过程中上样体积、淋洗体积和样品洗脱溶剂的强度都将影响净化效果和回收率，因此，要选择最佳净化条件。刘媛等[11]在同时检测鸡蛋中的CIP、DNA、ENR、SAR时采用反相C18固相萃取柱，分别对上样体积、淋洗液的体积和不同洗脱溶剂等条件进行了优化。10mL溶液上样，2mL水淋洗，30%乙腈的0.05M的磷酸—三乙胺缓冲液作为洗脱溶剂，只用1ml洗脱溶剂，各种沙星的回收率已达82.0－95.7%。
    可以通过流动注射使净化过程在线完成，Holtzapple等[12]采用在线净化柱和高效液相免疫柱联用检测牛乳清中的CIP、ENR、SAR和DIF，效果良好。Ho[13]等在检测牛奶中的喹诺酮时采用在线提取净化。萃取柱由亲水—亲脂性聚合物吸附剂填充，matrix移走后，被分析物就从萃取柱直接进入色谱柱进行分离。此萃取柱在提取样品的同时，将分析物与样品中的基质进行了分离。净化柱和分离柱联用可以减少样品的制备步骤和有机溶剂的用量，还可以节约时间和减少工作量，是一种值得进一步研究和推广的方法。

3分离
    大多数采用高效液相色谱（HPLC）分离，也可用毛细管电泳分离，由于QNS的熔点比较高，用气相色谱（GC）的较少。
    反相HPLC已经成为QNS药物残留的主要分析方法[14-17]，广泛使用反相键合相（C18、C8 、C5等），固定相表面存在酸性位点，而QNS结构上的叔胺基和羧基官能团在水中能电离，这些酸性位点可通过氢健或离子交换强烈吸附QNS，出现色谱峰拖尾，保留值不稳定或过长。优化流动相的组成是控制保留值和选择性最方便的方法，还可采用端基封闭健合相。流动相一般采用乙腈—甲醇—磷酸盐缓冲液，pH值保持在2－4之间，目的是减少硅烷醇电离，减少与喹诺酮类的相互作用，除了磷酸缓冲溶液被用来调节pH值外，也可用柠檬酸、草酸等。温度一般控制在30℃—50℃，这样可以降低流动相的粘度，降低柱压力。
    Ramos等[18]同时检测食品中的ENR、CIP、SAR、OXO 和FLU时，通过改变pH值、离子强度、磷酸缓冲溶液来优化HPLC的条件。在保持一定的离子强度和缓冲液与乙腈的比例下改变pH值，在pH为3.0时，保留时间最短；比较了不同pH值下Symmetry C18柱和 Supelcosil ABZ Plus柱的分离性能，改变pH值Symmetry C18柱比Supelcosil ABZ Plus柱对峰形的影响要小；前者在测试的整个pH值范围内没有拖尾峰，然而在第二根色谱柱上，pH3.5时，就已经拖尾。缓冲溶液的离子强度对保留时间的影响很小甚至没有；在一定的pH和离子强度下，QNS的保留时间对乙腈的比例变化非常灵敏，当乙腈含量＜10%时，保留时间太长，所以，分离的最佳条件是：流动相为乙腈与0.02M磷酸缓冲液在pH3.0时以15：80（V：V）的比例混合。
    当等梯度难以分离多种药物时，可采用梯度洗脱的方法使几种物质达到最佳分离。Pecorelli等[19]在对13种QNs（CIN、CIP、DAN、DIF、ENO、ENR、FLU、NAL、NOR、OFL、OXO、PIP、RUF）在C5柱进行分离检测时，采用了梯度洗脱的方法，使13种QNs同时得到分离。流动相由A、B两种溶液组成，A为乙腈—四氢呋喃－0.04MKH2PO4（50：1：49），pH控制在2.6；B为乙腈－四氢呋喃－0.04M KH2PO4（10：1：89），pH控制在2.6。流动相以100%的B开始，运行至15min时为95%的B，25min时流动相变为100%的A，30min时又回到100%的B。
Marazuela等[5]在分离牛奶中的QNs时，采用了端基封闭柱AQUATM，利用梯度洗脱，没有用离子对试剂，六种QNS在短时间（13min）内分开了。流动相由A、B两种溶液组成，A是25mM磷酸，用NaOH调节pH到3.0，B是乙腈。
    Bailac等[20]在检测鸡肉中的喹诺酮时，为了得到短的分离时间和好的分离度，对不同固定相基质的C8柱（Zorbax, Inertsil和 Chromalsil）和C18柱 （Lichrospher,和Nucleosil）进行了对比，发现在C18柱上比在C8柱上得到的峰形宽；将不同的电解质溶液作为流动相中的水相部分进行比较，包括乙酸铵、酢浆草酸、磷酸、三氟乙酸、三乙胺、乙酸和柠檬酸。最后选择了C8 Zorbax和柠檬酸。

4检测
    QNS具有强的紫外吸收和荧光特性，所以经色谱分离后，常采用紫外检测器（UVD）、荧光检测器（FLD）。光电二极管阵列检测器（DAD）是近年发展起来的新型检测器，这种检测器的使用，对复杂基质中残留药物的鉴别具有独特的优势。Cinquina等人利用DAD对山羊奶中ENR和CIP的分离检测方法进行了优化和验证[21]。液相与多级质谱联用（LC－MSn）灵敏度和选择性都很高，在QNS的确证分析中应用较多。
    喹诺酮类药物在紫外区有两个吸收带，一个是在300－350nm，对所有的喹诺酮都是相同的，另一个是在245－290nm，每一种喹诺酮在此吸收带的吸收波长都是不同的，而且后一吸收带的吸收强度高于前者，所以常被选来做测定波长。
    在荧光检测中，FQS与其它的QNS的荧光光谱有差异，一般FQS采用激发波长为277－280nm，发射波长为365－445nm。不同于紫外吸收，荧光吸收强度很大程度上依赖于介质pH值。由于阴离子形式不显示本身的荧光，所以最大荧光量是在最小pH值处得到（2.5－4.5），此时是以阴离子或中性形式存在。由于在分离时采用的pH值为2－4，所以流动相的pH值最适于荧光检测。利用每种QNS各自的吸收特征，就可以分析检测不同的种类。
    现在多残留分析常借助于更灵敏更新的联用分析技术，如液相色谱－质谱联用（LC－MS，LC－MS－MS）可进行确证分析，而且可获得更低的检测限。Johnston等[6]用液相色谱－电喷雾－质谱（LC－ESI－MS）测定鲑鱼、虾、鲍鱼中8种喹诺酮类药物 (OXO、FLU、PIR、ENR、CIP、DAN、SAR、ORB)，检测限为1－3ng/kg。Tumipseed等[22]用离子捕获LC－MSn检测了鲑鱼肉中的CIP、ENR、SAR、DIF的残留情况。
    毛细管电泳的检测灵敏度也较高，但由于其重现性的问题，报道的较少。Fierens等人[23]对第一代和第二代喹诺酮类用毛细管电泳进行了定性、定量分析，Hemandez[24]等用固相萃取毛细管电泳分离血浆样品中的QNS 。Barrón等[25]用固相萃取毛细管电泳检测了鸡肉中的FLU和OXO。
    非色谱方法基于免疫分析和荧光技术，如：Lian等[26]用Tb（Ⅲ）敏化，检测CIP。Rodr´ıguez-D´ıaz等[27]用TB（Ⅲ）和铕（Ⅲ）作为干试剂敏化化学荧光检测CIP和四环素。Giménez等[28]采用荧光激发发射的方法检测喹诺酮，这些方法通常具有高的灵敏度，但很难完成多种药物的同时测定。

5总结
    近年来，分析动物类食品中的喹诺酮类的文章逐年增多，随着食品安全标准的提高，为分析工作者提出了更高的要求，对多残留进行分析，主要从以下两方面来进行研究，以提高监测水平：一是借助于更先进的提取技术和净化技术，二是利用更灵敏更新的联用技术来满足逐步提高的标准。

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